Embrião vermelho respira

O teste de tetrazólio responde bem mais rápido que o de germinação a uma pergunta simples. A semente está viva?

A animação acima usa uma imagem real de sementes de orquídea depois do tetrazólio, do conjunto anotado pelo GPEOrq. Das 65 sementes anotadas, 36 têm o embrião vermelho e foram marcadas como viáveis, e 29 ficaram pálidas. A viabilidade da placa sai em 55,4% (36 de 65).

Semente de orquídea é quase só embrião e casca. Não tem reserva, e o embrião é uma bolinha de células sem raiz nem folha formada. É ele que o tetrazólio pinta.

Do selênio ao tetrazólio

O teste tem autor e data. Na Alemanha, o pesquisador Georg Lakon procurava um jeito químico de ver, no corte da semente, quais partes estavam vivas. A primeira versão usava biselenito de sódio, que também marca o tecido vivo, mas é tóxico. Em 1942, Lakon publicou o método com sais de tetrazólio, que fazem o mesmo serviço sem o veneno.

O teste foi usado na Alemanha durante a guerra e logo saiu de lá. Em 1947, a revista Nature já trazia um artigo inglês avaliando o sal como indicador de germinação de cereais. Hoje ele está nas regras de análise de sementes de vários países, inclusive nas brasileiras.

A química da cor

A semente é hidratada e posta numa solução de sal de tetrazólio, inteira ou já cortada, conforme a espécie. O sal entra incolor. No tecido vivo, enzimas desidrogenases, ativas na respiração, reduzem o sal a formazana, um composto vermelho que não se dissolve e fica preso no tecido. Tecido morto não respira e continua pálido.

Por isso o teste também serve para semente dormente, que está viva mas não germinaria no prazo do teste de germinação.

A cor, então, é o registro da respiração. Embrião vermelho respira. Embrião pálido, não.

A máquina propõe, a pessoa confere

No SeedCounter, a máquina olha cada semente e propõe uma classe. A proposta aparece primeiro e só vira dado quando você confere. No tetrazólio, essa ordem importa, porque a leitura de quem analisa vai além de ter ou não ter vermelho.

• Onde está a cor conta. Uma área pálida no eixo do embrião pesa mais que uma na ponta do cotilédone.
• A intensidade conta. Vermelho muito escuro, carmim, costuma indicar tecido em deterioração, e branco leitoso indica tecido morto.
• A luz conta. Sem um cartão cinza na cena, o mesmo vermelho muda de uma foto para outra.

As Regras para Análise de Sementes descrevem esses critérios para cada espécie. A máquina ajuda a passar pelas sementes mais rápido. O critério continua com você.

Quantas sementes bastam?

A placa do alto dá 55,4% de viabilidade. Só que 65 sementes ainda deixam uma margem larga. A animação lê as mesmas 65 sementes reais, uma a uma, numa ordem sorteada, e desenha a viabilidade acumulada com a faixa onde o valor verdadeiro deve estar, com 95% de confiança.

Nas primeiras sementes, a faixa ocupa quase o gráfico inteiro. Com as 65, ela vai de 43% a 67%, uns 12 pontos para cada lado. Se a placa tivesse 200 sementes na mesma proporção, a margem cairia para uns 7 pontos. Com 400, para 5. Por isso os testes oficiais usam centenas de sementes, divididas em repetições, e não uma placa só.

A margem não depende da máquina nem de quem lê. Ela vem só do tamanho da amostra. Com a conferência semente a semente, o SeedCounter cuida da outra parte, a de cada semente estar na classe certa.

Forma além da cor

No SeedCounter, viável recebe um disco ciano, cheio. Inviável recebe um anel magenta, vazado. As duas classes diferem na forma, além da cor.

A gente fez assim por dois motivos. Muita gente não distingue bem certos pares de cores, e o par vermelho e verde é o caso mais conhecido. E um laudo impresso em preto e branco perde a cor. A forma continua lá. No app, fica assim.

Tem uma placa de tetrazólio fotografada? Carregue no SeedCounter, confira as classes e veja a viabilidade sair com o número de cada semente.

Para ir mais fundo: a estatística do laudo, a concordância com o analista e quando a cor esconde uma classe.

Fontes

• Cottrell, H. J. (1947). Tetrazolium salt as a seed germination indicator. Nature, 159, 748, que cita o método de Lakon com biselenito e o de 1942 com tetrazólio. Nature
• Sementes de Orquídeas, versão 8, anotado pelo GPEOrq, CC BY 4.0. Roboflow Universe
• A faixa de 95% é o intervalo de Wilson para proporções. Wikipedia. A conta está na cena tz-margem, em assets/cena.js.

Para a conta inteira: Cor e classe, com 1.614 sementes reais de orquídea no tetrazólio.