Teste de tetrazólio, do preparo à porcentagem.

Por que a semente fica vermelha

O sal usado é o cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio. Ele entra na semente incolor e solúvel. No tecido vivo, as desidrogenases, enzimas da respiração, entregam elétrons ao sal, que vira formazana: um composto vermelho, insolúvel, que fica preso na célula onde se formou. Tecido morto não respira, não reduz o sal e continua branco.

Como a formazana não se espalha, a cor desenha um mapa da semente. É por isso que o teste se chama topográfico: o analista não pergunta só se há vermelho, pergunta onde. O método foi publicado por Georg Lakon em 1942, primeiro para cereais e logo depois para o milho [1], e hoje está nas regras de análise de sementes do Brasil e da ISTA [2][7].

Passo a passo

O roteiro é o mesmo para quase todas as espécies. O que muda de uma para outra é a hidratação, o preparo antes da solução, a concentração e o tempo, e isso está na tabela da seção seguinte.

1. Separe a amostra

   No teste oficial de soja, as regras brasileiras pedem 400 sementes, em 4 repetições de 100 ou 8 de 50, ou 200 como opção. Para controle interno da empresa, 100 sementes em duas subamostras de 50 bastam [4]. Sorteie as sementes da amostra de trabalho, sem escolher as bonitas.

2. Hidrate

   A semente seca não cora bem. Na soja, ela passa 16 horas a 25 °C enrolada em papel de germinação umedecido com 2,5 vezes o peso do papel seco; a versão rápida é de 6 horas a 41 °C [4][5]. A hidratação lenta, no papel, evita que a semente trinque por absorver água rápido demais.

3. Prepare a semente

   A solução precisa chegar ao embrião. A soja hidratada vai inteira e só é cortada na leitura. No café, a casca sai e o embrião é extraído antes de corar [3]. Muitas gramíneas são cortadas ou perfuradas antes. A orquídea, quase só embrião e casca, cora inteira.

4. Core no escuro

   Cubra as sementes com a solução e deixe em estufa ou banho-maria, no escuro, porque a solução se decompõe na luz. Na soja, 0,075% por 150 a 180 minutos a 35 a 40 °C, preparada a partir de uma solução estoque de 1% [4].

5. Lave e corte para ler

   Lave em água e mantenha as sementes úmidas até a leitura, porque o tecido que seca muda de cor. Na soja, corte cada semente ao meio no sentido do comprimento, passando pelo eixo embrionário, com lâmina de barbear, e examine as duas faces dos cotilédones numa lupa de 6 vezes [4].

6. Classifique cada semente

   Olhe a cor, a posição e o tamanho de cada área sem cor. A regra geral da soja é que um dano no eixo que não chega ao cilindro central mantém a semente viável, e um dano que chega ao cilindro central a torna inviável [4]. As duas seções sobre cores e classes, mais abaixo, mostram como.

7. Calcule e confira as repetições

   A viabilidade é o número de viáveis dividido pelo total, em porcentagem, em cada repetição e na média. Se a diferença entre a maior e a menor repetição passar da tolerância da Tabela 5.1 das regras, o teste se repete [3]. A calculadora da seção Calcular faz a conta e mostra a margem.

O método muda com a semente

Três exemplos com o método publicado, de sementes bem diferentes. Para as demais espécies, o Quadro 5.1 das regras brasileiras traz a hidratação, o preparo, a concentração e o tempo de cada uma [3].

No café, as regras aceitam até metade dos cotilédones sem cor, desde que a mancha não atinja a região por onde passam os nutrientes para o eixo [3]. Na orquídea, a pesquisa do GPEOrq com o Kew comparou concentrações de 0,1 a 1% e tempos de 3 a 24 horas contra a germinação em meio de cultura, e recomendou mais de 0,25% e mais de 6 horas pela economia e pela rapidez, mesmo sem a sacarose [6].

Ler as cores

Três tons resumem a leitura [4]. Vermelho-carmim claro e uniforme é tecido vivo e vigoroso. Vermelho-carmim forte, quase roxo, é tecido em deterioração: ele respira mais porque está se desfazendo, e não porque está melhor. Branco leitoso é tecido morto. O peso de cada mancha depende de onde ela cai.

A cor muda com a luz e com o tempo de leitura. Leia sob a mesma lâmpada, com as sementes ainda úmidas, e, se for fotografar, ponha um cartão cinza na cena para dar para comparar uma foto com a outra.

As oito classes da soja

Na soja, a Embrapa organizou a leitura em oito classes, de 1 a 5 para as viáveis e de 6 a 8 para as não viáveis [4]. No laudo, o vigor costuma sair como a soma das classes 1 a 3 e a viabilidade como a soma das classes 1 a 5.

A classe vem acompanhada da causa. O manual separa três danos principais [4]. O dano mecânico aparece como trinca na semente muito seca e como amassado na mais úmida, vermelho escuro quando é recente e branco e flácido quando é antigo. A deterioração por umidade deixa lesões simétricas nos dois cotilédones, muitas vezes com rugas. O percevejo deixa lesões redondas, com centro branco e um anel vermelho intenso em volta. Saber a causa diz onde o lote se perdeu: na colheita, no campo ou no armazém.

Calcular a viabilidade e a margem

A conta é simples: viáveis divididas pelo total. O que costuma faltar no laudo é a margem. Uma placa com poucas sementes dá uma porcentagem, mas o valor verdadeiro do lote pode estar bem longe dela. A calculadora usa o intervalo de Wilson, com 95% de confiança, que funciona bem também perto de 0 e de 100%. Ela também confere se as repetições concordam entre si, mostra quantas sementes seriam precisas para uma margem menor e deixa copiar, baixar em planilha ou mandar o link da conta.

Com as 65 sementes da placa de orquídea, a viabilidade sai em 55,4%, e a faixa vai de 43% a 67%. Com 400 sementes na mesma proporção, a faixa cairia para cerca de 5 pontos para cada lado. É por isso que as regras pedem centenas de sementes em repetições, e não uma placa só. A conta completa, com o porquê de cada intervalo, está em Proporções e intervalos.

Três casos, na calculadora

Situações que aparecem toda semana no laboratório. Cada caso abre na calculadora acima, com os números prontos para você mexer.

Tetrazólio ou germinação?

Os dois testes respondem perguntas parecidas, mas não iguais. Muitos laboratórios fazem os dois, e a diferença entre eles também é informação.

Quando o tetrazólio dá bem mais que a germinação, as hipóteses comuns são dormência, fungo ou um tratamento de sementes que atrapalhou a plântula. Quando a germinação dá mais, vale desconfiar da leitura do tetrazólio ou da amostragem.

Os erros que mais mudam o resultado

• Hidratar rápido demais, em água direta, quando a espécie pede papel úmido. A semente trinca e o dano criado na bancada vira dano do lote.
• Deixar a solução no claro ou usar solução velha. O sal se decompõe na luz e a cor sai fraca.
• Corar demais. Tempo ou temperatura acima do método escurecem tudo, e o vermelho de tecido vivo fica parecido com o carmim forte da deterioração.
• Ler com a semente seca ou sob luz diferente a cada dia. A cor muda, e a classe muda junto.
• Julgar pela área e não pela posição. Uma mancha pequena no cilindro central do eixo pesa mais que uma grande na ponta do cotilédone.
• Concluir com poucas sementes. Com uma placa de 50, a margem passa de 10 pontos para cada lado em lotes com viabilidade perto de 50%.

Ler por foto, conferir semente por semente

A leitura do tetrazólio é feita a olho, e é aí que uma foto ajuda. A imagem guarda a placa como estava, deixa outra pessoa conferir a mesma leitura e transforma a contagem em número por semente. No GPEOrq, as sementes de orquídea coradas vão para um scanner de mesa sobre papel azul, que contrasta com o vermelho e com a casca translúcida.

No SeedCounter, a máquina propõe o contorno de cada semente e uma classe, e a pessoa confere antes de o número valer. Viável recebe um disco ciano cheio e não viável um anel magenta vazado, para a classe continuar legível em impressão preto e branco e para quem não distingue bem vermelho e verde. Dá para criar as classes do seu protocolo, como as oito da soja, e marcar cada semente nelas. O laudo sai com a porcentagem e o número de cada semente.

Perguntas frequentes

Referências

1. Lakon G. (1942). Topographischer Nachweis der Keimfähigkeit der Getreidefrüchte durch Tetrazoliumsalze. Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft 60(6–7), 299–305. doi:10.1111/j.1438-8677.1942.tb00466.x. Para o milho, no mesmo ano: doi:10.1111/j.1438-8677.1942.tb00480.x
2. Brasil, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (2009). Regras para Análise de Sementes. Brasília: MAPA/ACS. 399 p.
3. Brasil, Ministério da Agricultura e Pecuária (2025). Regras para Análise de Sementes, revisão: Quadro 5.1, instruções para o teste de tetrazólio, e Tabela 5.1, tolerâncias entre repetições. Quadro 5.1 · Tabela 5.1
4. França-Neto J.B., Krzyzanowski F.C. (2018). Metodologia do teste de tetrazólio em sementes de soja. Documentos 406. Londrina: Embrapa Soja. 108 p. Infoteca Embrapa
5. Costa N.P., Marcos-Filho J., França-Neto J.B., Krzyzanowski F.C., Henning A.A. (2008). Teste de tetrazólio em semente de soja com precondicionamento abreviado. Circular Técnica 56. Londrina: Embrapa Soja. 8 p. Infoteca Embrapa
6. Hosomi S.T., Santos R.B., Custodio C.C., Seaton P.T., Marks T.R., Machado-Neto N.B. (2011). Preconditioning Cattleya seeds to improve the efficacy of the tetrazolium test for viability. Seed Science and Technology 39(1), 178–189. doi:10.15258/sst.2011.39.1.15
7. ISTA (2022). International Rules for Seed Testing, capítulo 6: The topographical tetrazolium test. Bassersdorf: International Seed Testing Association. doi:10.15258/istarules.2022.06

Para continuar: por que o embrião vermelho respira, cor e classe com 1.614 sementes reais de orquídea, como comparar a leitura de duas pessoas e o verbete tetrazólio no glossário.